Sus inicios profesionales se sitúan en la segunda mitad de la década de 1980, tanto en el ámbito de la televisión como del teatro. En la pequeña pantalla debuta en 1986 con un perqueño papel de reparto en la serie Segunda enseñanza, escrita por Ana Diosdado y dirigida por Pedro Masó. Se sube por primera vez a un escenario profesional un año más tarde en el madrileño teatro Alcázar para representar Coqueluche, de Roberto Romero, protagonizada por Mercedes Alonso. En los siguientes años compagina su actividad teatral con apariciones esporádicas en televisión, debutando finalmente en el cine en 1989 a las órdenes de Imanol Uribe en La luna negra.

En la segunda mitad de la década abandona los trabajos teatrales, coincidiendo con el estreno de sus mayores éxitos en la gran pantalla: Participa en Todo sobre mi madre, de Pedro Almodóvar, Más que amor, frenesí, de Alfonso Albacete y sobre todo protagoniza dos de los más importantes títulos de la filmografía de José Luis Garci: La herida luminosa (1997), junto a su padre y El abuelo (1998), con Fernando Fernán Gómez al frente del reparto, película nominada al Premio Oscar y que a Cayetana Guillén le valió también una nominación al Premio Goya a la Mejor Actriz protagonista.

En 1998 se estrena en su faceta de presentadora de televisión, labor que mantendría ininterrumpidamente, al menos los siguientes 15 años, siempre en la cadena La 2, de Televisión española, y en espacios culturales o específicamente enfocados al séptimo arte. Desde esa fecha está al frente del programa Versión española, con proyección de una película española y posterior entrevista con miembros del equipo artístico y técnico. Otros programas incluyen D-Calle (2006), Días de cine (2008-2011) y Atención obras, sobre las novedades teatrales.

En las décadas de 2000 y 2010 viene manteniendo una presencia habitual, tanto en cine como en teatro y televisión en este último caso, compaginando labores de actriz y de presentadora.

Desde la segunda mitad de la década de 2000 es, además, columnista del diario El Mundo.